Tiêu bản cố định là gì? Các công bố khoa học liên quan

Định nghĩa tiêu bản cố định

Tiêu bản cố định là mẫu vật sinh học đã được xử lý bằng các hóa chất hoặc kỹ thuật vật lý nhằm ngăn chặn các quá trình phân hủy và giữ nguyên cấu trúc mô học của mẫu trong thời gian dài. Việc cố định giúp ổn định hình thái tế bào, bảo toàn thành phần hóa học tương đối và chuẩn bị cho các bước phân tích tiếp theo dưới kính hiển vi.

Mục tiêu của cố định là “đóng băng” trạng thái sinh học của mẫu vật tại thời điểm thu thập, từ đó ngăn chặn sự hoạt hóa của enzyme phân hủy nội sinh, sự thoát nước, và sự biến đổi về hình thái. Nhờ quá trình này, cấu trúc tế bào và mô được duy trì gần nhất với điều kiện sống ban đầu, phục vụ cho việc phân tích mô học, miễn dịch học hoặc nghiên cứu tế bào học.

Tiêu bản cố định là nền tảng quan trọng không chỉ trong y học và sinh học phân tử mà còn được ứng dụng trong bảo tồn mẫu vật tại các bảo tàng, ngân hàng mô và phòng thí nghiệm nghiên cứu. Việc sử dụng đúng kỹ thuật cố định góp phần quyết định đến chất lượng hình ảnh vi mô và độ chính xác của phân tích mô bệnh học.

Các phương pháp cố định mẫu

Cố định mẫu được chia thành hai nhóm lớn: cố định hóa học và cố định vật lý. Mỗi nhóm có các kỹ thuật riêng phù hợp với mục tiêu sử dụng, loại mẫu, độ nhạy và thiết bị phòng thí nghiệm. Phương pháp lựa chọn phải cân bằng giữa hiệu quả bảo tồn mô và hạn chế tối thiểu các biến dạng hình thái học.

Cố định hóa học là phương pháp phổ biến nhất, sử dụng các chất như formaldehyde, glutaraldehyde, ethanol, hoặc osmium tetroxide để tạo liên kết chéo giữa các phân tử protein và axit nucleic. Nhờ vậy, cấu trúc tế bào được ổn định, không bị ly giải. Cố định hóa học có thể chia nhỏ thành hai dạng: đồng nhất (coagulant fixatives) và không đồng nhất (non-coagulant fixatives), tùy vào cách chúng tương tác với cấu trúc tế bào.

• Formalin (10% formaldehyde): dùng phổ biến trong mô học và lưu trữ mô lâu dài
• Glutaraldehyde: dùng trong kính hiển vi điện tử để bảo toàn siêu cấu trúc
• Alcohol (ethanol, methanol): phù hợp cho tế bào học và mẫu DNA/RNA
• Osmium tetroxide: bảo tồn lipid và màng sinh học, thường dùng cho TEM

Cố định vật lý là kỹ thuật sử dụng nhiệt độ hoặc lực vật lý để nhanh chóng ngăn cản hoạt động sinh học. Hai kỹ thuật nổi bật gồm:

• Đông lạnh nhanh: sử dụng nitơ lỏng để cố định mẫu sống tức thì
• Sóng vi ba: ứng dụng trong nghiên cứu thần kinh do cố định cực nhanh

Tiêu bản cố định trong mô học

Trong mô học, tiêu bản cố định giữ vai trò nền tảng trong việc bảo tồn cấu trúc mô trước khi trải qua các bước xử lý như khử nước, làm trong, đúc paraffin, cắt lát và nhuộm. Một mẫu không được cố định đúng cách sẽ dẫn đến hiện tượng co rút, thoái hóa hoặc mất đi đặc trưng vi mô quan trọng.

Dung dịch cố định tiêu chuẩn trong mô học là formalin trung tính 10%, thường được pha từ formaldehyde đậm đặc (37–40%) với đệm phosphate để duy trì pH ở mức ~7.0. Thời gian cố định phụ thuộc vào kích thước mẫu, thông thường kéo dài từ 6 đến 24 giờ ở nhiệt độ phòng để đảm bảo dung dịch thấm đều vào sâu trong mô.

Quá trình cố định không chỉ giữ được hình thái học mà còn ảnh hưởng đến hiệu quả của các kỹ thuật nhuộm sau đó như H&E (hematoxylin-eosin), PAS hoặc nhuộm miễn dịch huỳnh quang. Đối với các nghiên cứu cần phân tích enzyme hoặc protein, phải lựa chọn chất cố định không phá hủy epitope mục tiêu.

Bước	Chức năng	Lưu ý kỹ thuật
Cố định	Ổn định cấu trúc mô	Dùng formalin trung tính 10%
Khử nước	Loại nước bằng ethanol tăng dần	Bắt đầu từ nồng độ thấp
Làm trong	Thay ethanol bằng dung môi hữu cơ	Thường dùng xylene
Đúc paraffin	Gắn mẫu vào khối sáp	Phải hoàn toàn khô và đồng nhất

Cố định mẫu trong kính hiển vi điện tử

Đối với kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoặc quét (SEM), yêu cầu cố định khắt khe hơn so với hiển vi quang học vì phải bảo tồn siêu cấu trúc ở cấp độ nano. Trong TEM, quá trình cố định thường trải qua hai giai đoạn: sơ cấp bằng glutaraldehyde và hậu cố định bằng osmium tetroxide.

Glutaraldehyde tạo liên kết chéo mạnh mẽ giữa các nhóm amine của protein, giúp bảo vệ cấu trúc tế bào khỏi biến dạng trong quá trình xử lý. Osmium tetroxide, với khả năng gắn vào lipid màng, giúp giữ nguyên hình thái màng sinh học và đồng thời tăng độ tương phản tự nhiên cho mẫu vật.

1. Sơ cấp: glutaraldehyde 2.5% trong đệm phosphate, 2–4 giờ ở 4°C
2. Hậu cố định: osmium tetroxide 1% trong đệm phosphate, 1 giờ

Sau cố định, mẫu sẽ được khử nước qua dãy ethanol, làm trong bằng propylene oxide, nhúng nhựa epoxy và cắt lát siêu mỏng (60–90 nm) trước khi nhuộm với uranyl acetate và chì citrate để tăng độ tương phản. Tiêu bản cố định đúng chuẩn sẽ cho hình ảnh rõ ràng các cấu trúc như màng nhân, ty thể, ribosome, vi ống.

Các chất cố định thông dụng

Việc lựa chọn chất cố định phù hợp phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu, loại mô hoặc tế bào, và phương pháp phân tích tiếp theo. Các chất cố định được phân thành nhiều nhóm dựa theo cơ chế hoạt động và ứng dụng thực tế trong sinh học phân tử, mô học hoặc hiển vi điện tử.

Một số chất cố định phổ biến gồm:

Tên chất	Loại	Ứng dụng chính	Ghi chú
Formalin 10%	Hóa học (aldehyde)	Tiêu bản mô học, lưu trữ dài hạn	Rẻ, dễ dùng, phổ biến nhất
Glutaraldehyde	Hóa học (dialdehyde)	Kính hiển vi điện tử	Bảo toàn siêu cấu trúc tốt
Osmium tetroxide	Hóa học (oxid hóa)	Cố định lipid, TEM	Rất độc, cần xử lý an toàn
Ethanol/Methanol	Hóa học (rượu)	Tế bào học, bảo toàn axit nucleic	Không giữ tốt cấu trúc protein
Nitơ lỏng	Vật lý	Đông lạnh mẫu sống	Cần thiết bị chuyên dụng

Một số trường hợp đòi hỏi kết hợp nhiều chất cố định theo chuỗi để tối ưu hóa hiệu quả bảo tồn. Ví dụ, trong phân tích miễn dịch huỳnh quang, người ta thường dùng formalin để cố định mô trước, sau đó khử aldehyde và tiếp tục với ethanol để giảm nền không đặc hiệu.

Ý nghĩa trong nghiên cứu và bảo tồn

Tiêu bản cố định có giá trị lâu dài trong nghiên cứu khoa học và lưu trữ mẫu sinh học. Khi được cố định đúng kỹ thuật, mẫu có thể được bảo tồn hàng tháng đến nhiều năm mà không bị phân hủy, đồng thời vẫn giữ lại các thông tin quan trọng về cấu trúc và thành phần hóa học của tế bào.

Trong nghiên cứu mô bệnh học, việc cố định mô kịp thời và chính xác giúp bác sĩ giải phẫu bệnh xác định được chính xác mức độ tổn thương, sự phân bố tế bào u, đặc điểm viêm hoặc sự hiện diện của vi sinh vật. Trong nghiên cứu hệ gen và proteomics, một tiêu bản tốt giúp định vị chính xác các marker phân tử trong mô.

Ngoài ra, tiêu bản cố định còn được sử dụng trong:

• Ngân hàng mô (biobank) lưu trữ mẫu cho nghiên cứu lâm sàng
• Bảo tàng sinh học: lưu trữ loài điển hình cho mục đích phân loại
• Giảng dạy: tiêu bản học mẫu chuẩn cho đào tạo y khoa, thú y, sinh học

Tại các bảo tàng hoặc trung tâm phân loại học, tiêu bản cố định chuẩn (type specimen) được xem là tài liệu tham khảo chính thức trong mô tả loài mới. Tính chính xác và ổn định lâu dài của các tiêu bản này là nền tảng cho phân loại và danh pháp sinh học.

Hạn chế và sai số kỹ thuật

Mặc dù tiêu bản cố định rất quan trọng, quá trình cố định vẫn có thể gây ra các biến dạng hoặc mất thông tin sinh học nếu không được thực hiện đúng kỹ thuật. Sai số thường phát sinh từ việc lựa chọn chất cố định không phù hợp, thời gian cố định không đủ hoặc pH dung dịch sai lệch.

Một số lỗi phổ biến:

• Cố định quá lâu: làm cứng mô, giảm tính thấm thuốc nhuộm
• Cố định không đầy đủ: gây ly giải, hoại tử mô
• Sai pH: ảnh hưởng đến liên kết protein và hình ảnh giả tạo
• Sai tỷ lệ mẫu/dung dịch: không đủ hóa chất thấm đều mô

Đối với các nghiên cứu liên quan đến kháng thể, sai cố định còn có thể làm mất epitope, dẫn đến kết quả nhuộm miễn dịch âm tính giả. Vì vậy, mỗi phương pháp nghiên cứu nên đi kèm với quy trình cố định riêng biệt đã được chuẩn hóa.

Tiêu chuẩn và an toàn trong cố định mẫu

Nhiều chất cố định như formalin và osmium tetroxide có độc tính cao và gây kích ứng mạnh cho da, mắt và đường hô hấp. Việc sử dụng các hóa chất này đòi hỏi tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn an toàn hóa học trong phòng thí nghiệm và có thiết bị bảo hộ cá nhân đầy đủ.

Một số yêu cầu cơ bản:

1. Sử dụng tủ hút khi thao tác với hóa chất bay hơi
2. Đeo găng tay nitrile và kính bảo hộ
3. Không để hóa chất tiếp xúc trực tiếp với da hoặc niêm mạc
4. Lưu trữ hóa chất ở nơi thoáng mát, có dán nhãn rõ ràng

Các tổ chức như CDC và OSHA đã ban hành nhiều hướng dẫn về tiếp xúc an toàn với formaldehyde. Xem hướng dẫn chi tiết tại CDC - Formaldehyde Safety Guidelines.

Xu hướng hiện đại và công nghệ mới

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các phương pháp cố định mới đang được nghiên cứu nhằm hạn chế độc tính, tăng tính tương thích sinh học và hỗ trợ tốt hơn cho phân tích đa dạng như miễn dịch học, transcriptome hoặc phân tích ảnh 3D.

Một số kỹ thuật hiện đại đáng chú ý:

• CLARITY: làm trong mô cố định, loại bỏ lipid giúp quan sát mô 3D mà không cần cắt lát
• Expansion Microscopy (ExM): cố định mẫu trước khi làm phồng vật lý để tăng độ phân giải hiển vi
• PEG-fixation: sử dụng polyethylen glycol ít độc hơn thay cho formalin trong một số nghiên cứu miễn dịch

Những công nghệ này đang mở rộng khả năng phân tích hình ảnh mô học không phá hủy, đồng thời hỗ trợ nghiên cứu trong các lĩnh vực mới như sinh học thần kinh, ung thư học và phát triển phôi.

Tài liệu tham khảo

1. ScienceDirect - Fixation
2. CDC - Formaldehyde Safety
3. Bozzola, J.J., & Russell, L.D. (1999). Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. Jones & Bartlett.
4. Carson, F.L., & Hladik, C. (2009). Histotechnology: A Self-Instructional Text. ASCP Press.
5. Nature Methods - Expansion Microscopy
6. Nature Methods - CLARITY Protocol